CONCEPTOS BÁSICOS RELACIONADOS CON LOS MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS Y EL MUESTREO: PARTE 1

¿Por qué realizamos muestreo y ensayos microbiológicas en los alimentos?

La presencia de ciertos microorganismos en los alimentos puede afectar la salud pública y la calidad de los alimentos consumidos. Por esta razón, el muestreo y los ensayos de alimentos para una variedad de microorganismos es una parte común de la mayoría de los sistemas de inocuidad y calidad de los alimentos.

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Los principales usos del muestreo microbiológico en la industria alimentaria son los siguientes:

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• Pruebas de cumplimiento: Las agencias reguladoras de salud pública a menudo toman muestras y ensayan productos alimenticios en el mercado para el cumplimiento de las normas nacionales de inocuidad de los alimentos, por ejemplo, Listeria monocytogenes en algunos alimentos listos para comer (RTE). Los fabricantes de alimentos a veces también usan "ensayo y retención" para demostrar cumplimiento antes de liberar el producto en el mercado.

• Pruebas de certificación de importación y exportación: Los organismos reguladores de la inocuidad de los alimentos pueden requerir que los productos alimenticios se muestreen y ensayen para patógenos de interés en la salud pública antes de la importación / exportación, por ejemplo, Escherichia coli O157 en empaques de carne vacuna antes de la exportación a los Estados Unidos de América.

• Acuerdos comerciales de suministro: Los acuerdos comerciales a menudo incluyen especificaciones microbianas que el proveedor debe cumplir. El proveedor puede necesitar demostrar el cumplimiento mediante el muestreo y el ensayo del producto antes del envío, mientras los clientes pueden ensayar el producto al azar para verificar el cumplimiento.

• Verificación del proceso: Los fabricantes de alimentos pueden utilizar el muestreo y los ensayos para demostrar que un proceso de producción de alimentos está bajo control y funciona como se pretende.

 

¿Qué necesitamos recordar sobre las características de las poblaciones microbiológicas en los alimentos?

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A pesar de las diferentes razones de las pruebas microbiológicas de los alimentos hay una serie de factores comunes que son parte integral de la comprensión de la eficacia de los programas de ensayos.

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La capacidad de detectar microorganismos de interés es relativamente fácil cuando el grado de contaminación de los alimentos es alto. Sin embargo, a medida que el nivel, o concentración, de los microorganismos cae, se vuelve cada vez más difícil detectarlos a pesar de estar presentes. Esto refleja la naturaleza particulada de los microorganismos, lo que significa que a concentraciones muy bajas existe una clara posibilidad de que un microorganismo no esté presente en una muestra dada (Figura 1). Esto difiere de los contaminantes químicos, que generalmente se supone que están distribuidos más uniformemente a través del producto alimenticio, o al menos en la unidad analítica después de la homogeneización durante la preparación de la muestra de laboratorio.

figura 1

 

Por consiguiente, en muchas situaciones sólo una proporción de todas las unidades de un lote de alimentos contendrá el microorganismo diana. En las áreas de inocuidad de los alimentos, epidemiología y salud pública, este fenómeno (denominado a veces tasa de defectos en términos de ingeniería) se conoce comúnmente como prevalencia, mientras que la proporción defectuosa o porcentaje no conforme son términos utilizados frecuentemente en el muestreo de aceptación y en el control estadístico del proceso. Usamos el término "prevalencia" para denotar la proporción real, desconocida de unidades de alimento en un lote que está contaminado, generalmente con un patógeno, y el término "probabilidad de detección de unidad analítica", o simplemente "probabilidad de detección", para indicar la estimación Obtenidos de la muestra, utilizando una prueba microbiológica particular y una cantidad de unidad analítica.

Como se indicó anteriormente, la detección de microorganismos se hace más difícil cuanto menor es la prevalencia. Por ejemplo, si usted tiene una prevalencia del 50% (es decir, 1 en 2 unidades de alimentos contiene el organismo objetivo), entonces estaría muy seguro de seleccionar una unidad de alimentos contaminados (y por lo tanto, detectar microorganismos) O Cuatro unidades. Por el contrario, si tuviera una prevalencia de sólo el 1% (es decir, 1 de cada 100 unidades de alimentos contiene microorganismos) entonces tendría que probar muchas más unidades de alimentos para tener un nivel similar de confianza. % Probabilidad de detección si sólo el 1% de las unidades de alimentos están contaminados. En otras palabras, a medida que un proceso se hace más controlado y el grado de contaminación de alimentos disminuye, se hace más difícil encontrar el microorganismo por muestreo. Por lo tanto, es necesario aumentar el número y / o el tamaño de las unidades analíticas para detectar el organismo diana, si está presente, o tener alta confianza en que el organismo no está presente o está presente sólo a niveles muy bajos. Esto se convierte en un factor limitante en la detección directa de microorganismos patógenos y, por lo tanto, la falta de utilidad en el uso del muestreo como una forma de "controlar" la inocuidad de los alimentos.

Como se ha indicado anteriormente, la detección de microorganismos se hace más difícil cuanto menor es la prevalencia. Por ejemplo, si se tiene una prevalencia de 50% (es decir, 1 de cada 2 unidades de alimentos contiene el organismo objetivo), entonces hay una alta seguridad de seleccionar una unidad contaminada de alimentos (y, por tanto, detectar los microorganismos). Por el contrario, si tuviera una prevalencia de sólo 1% (es decir, 1 de cada 100 unidades de alimentos contienen los microorganismos), entonces se tendrían que ensayar muchas más unidades de alimento para tener un nivel similar de confianza. Por ejemplo, se necesitan unas 300 unidades para lograr una probabilidad de detección del 95% si sólo el 1% de las unidades de alimentos están contaminadas. En otras palabras, a medida que un proceso se hace más controlado y el grado de contaminación del alimento disminuye, se hace más difícil encontrar el microorganismo por muestreo. Por lo tanto, es necesario aumentar el número y / o el tamaño de las unidades analíticas para detectar el organismo diana, si está presente, o tener alta confianza en que el organismo no está presente o está presente sólo a niveles muy bajos, por ejemplo, para verificar el cumplimiento. Esto se convierte en un factor limitante en la detección directa de microorganismos patógenos y, por lo tanto, limita la utilidad del muestreo como forma de "controlar" la seguridad de los alimentos.

Por esta razón, cuando los niveles de contaminación de patógenos son bajos, un enfoque alternativo es utilizar organismos indicadores de higiene para identificar las condiciones de procesamiento que pueden tener una mayor probabilidad de conducir a la contaminación con patógenos. Los indicadores de higiene son microorganismos que típicamente ocurren a concentraciones sustancialmente más altas en el alimento que el patógeno. Los métodos de ensayo cuantifican estos niveles, permitiendo así que las decisiones se basen en la concentración del microorganismo en lugar de su mera presencia. Sin embargo, en algún momento la presencia / ausencia de un indicador de higiene podría ser utilizado para determinar la efectividad de un proceso específico. Por ejemplo, un procesamiento térmico efectivo debe hacer que un alimento esté libre de cualquier indicador de higiene y su presencia podría indicar un fallo del proceso. La cuantificación de microorganismos también puede ser importante para patógenos específicos que pueden ocurrir con mayor frecuencia en concentraciones más altas en algunos alimentos sin causar riesgos para la salud pública, por ejemplo, Listeria monocytogenes (en alimentos que no sustentan su crecimiento), Campylobacter spp., Staphylococcus aureus, o Vibrio parahaemolyticus patógeno.

¿Cómo difieren los ensayos microbiológicos de los ensayos químicos?

Un aspecto importante de los métodos de ensayo microbiológicos es el concepto del límite inferior de detección. Este se originó en el análisis de productos químicos, pero no es directamente aplicable a la detección de microorganismos. En este caso, cuando el número de microorganismos es muy bajo, no es la capacidad del método para detectar el microorganismo lo que determina el resultado de la prueba, sino más bien es la probabilidad de que una célula estuviera realmente presente en la unidad analítica analizada. Por ejemplo, si un método está analizando 10 μl y el organismo está presente a un nivel de 1 célula por ml, entonces la probabilidad de que 10 μl contenga el microorganismo es (aproximadamente) 1 en 100 o 1% (Figura 1). Esto es una consecuencia de la naturaleza particulada de los microorganismos.

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Este fenómeno da lugar a una diferencia clave en la interpretación del término "homogéneo" entre las pruebas químicas y microbiológicas. En ambos casos, las muestras de alimentos se mezclan a fondo en el laboratorio de tal manera que la contaminación sea lo más uniforme posible en toda la matriz de la muestra. Este proceso se conoce como homogeneización y puede implicar una mezcladora, stomacher o instrumentos similares. Esto generalmente funciona muy bien para los contaminantes químicos y la interpretación en este contexto es que la contaminación es (más o menos) uniforme en toda la matriz de la muestra.

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Por el contrario, una muestra microbiológica homogeneizada tendrá el organismo objetivo 'flotante' en toda la matriz de la muestra. En este caso, el proceso de selección de una alícuota para el chapado implica un elemento de aleatoriedad y, por tanto, una probabilidad de que se encuentren diferentes números de organismos en cada muestra o submuestra.

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A veces podemos obtener 4 organismos en una placa y a veces pueden ser 5, u 11, o 1, o ninguno. Sin embargo, si la muestra es homogénea en un sentido microbiológico, entonces los recuentos de las placas replicadas seguirían un patrón aleatorio que, en términos estadísticos, es consistente con la distribución de Poisson (por ejemplo, como se muestra más adelante en la Figura 2). De hecho, es esta propiedad en la que se basa el enfoque del número más probable (MPN) aplicado a las pruebas microbiológicas (Cochran, 1950).

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Un punto clave a recordar es que, debido a la naturaleza particulada de los microorganismos, la homogeneidad en un entorno microbiológico no implica uniformidad, es decir, niveles constantes en toda la unidad analítica.

 

¿Cómo se distribuyen los microorganismos en los alimentos?

Los microorganismos pueden ser distribuidos (en un sentido espacial o temporal) a lo largo de un lote o proceso en una variedad de patrones. Estos están influenciados por el crecimiento / muerte microbianos y el tipo de procesamiento que se origina durante la producción, por ejemplo, unir y mezclar los ingredientes o llenar y embalar el producto final. Una buena descripción de los diversos mecanismos se puede encontrar en el documento producido por el International Life Sciences Institute Europe Risk Analysis in Food Microbiological Task Force (Bassett et al, 2010).

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En la figura 2 se presentan tres ejemplos de la distribución espacial bidimensional de los microorganismos en los alimentos: regular, aleatoria y agrupada. Estos patrones se producen debido a la naturaleza particulada del microorganismo y al funcionamiento de los ensayos microbiológicos. La siguiente lista proporciona ejemplos idealizados de cómo estos tres tipos de patrones de contaminación pueden ocurrir en los alimentos, aunque los patrones microbianos en muestras de alimentos reales pueden ser combinaciones de estos tres casos.

 

Un patrón de contaminación regular puede ser el resultado de eventos de contaminación en el proceso de producción, por ejemplo, una cabeza de relleno contaminada. La contaminación regular podría relacionarse con el intervalo entre unidades contaminadas, así como el número de organismos en un producto contaminado. Como consecuencia, la contaminación regular se caracteriza por una alta prevalencia de unidades contaminadas en el lote y una baja variabilidad en la concentración.

Un patrón de contaminación aleatoria suele ser el resultado de una mezcla completa o cuando ocurren eventos de contaminación al azar. No existe un patrón específico para la contaminación, lo que puede hacer más difícil encontrar una fuente. En un entorno microbiológico, esto daría lugar a una contaminación homogénea

Un patrón de contaminación agrupado puede ser el resultado de un evento de contaminación que es seguido por algún crecimiento del organismo y mezcla limitada del producto. Como resultado, las células individuales no se propagan ampliamente a través del alimento. Como consecuencia, la prevalencia de unidades contaminadas en el lote puede ser baja y la variabilidad en la concentración puede ser alta.

Estos diferentes patrones espaciales conducen a diferentes distribuciones estadísticas que describen matemáticamente los patrones de contaminación y también se puede encontrar información detallada sobre estas distribuciones en el documento ILSI (Bassett et al., 2010).

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Un punto clave a recordar es que no es posible generalizar cómo se distribuyen los microorganismos a través de un producto alimenticio, pero el conocimiento sobre el proceso y los mecanismos de contaminación será importante para determinar una distribución estadística adecuada y un plan de muestreo adecuado.

¿Por qué usamos los números log10 y por qué debemos tener cuidado al interpretarlos?

Los microorganismos crecen dividiéndose en dos, resultando en la duplicación del número de organismos durante cada ciclo de replicación. Por ejemplo, un organismo crecerá a 2, luego a 4, 8, 16, 32, etc. Esto se conoce como crecimiento exponencial y puede dar lugar a aumentos rápidos en poblaciones microbianas en condiciones adecuadas. Debido a que las poblaciones microbianas pueden ser grandes, por ejemplo, un billón de organismos por gramo, o 109 ufc / g, losmicrobiólogos de alimentos comúnmente convierten los números aritméticos a valores logarítmicos para simplificar el análisis de datos e interpretación. Mientras que cualquier transformación logarítmica puede lograr esto, el logaritmo en base 10 (log10) tiene una interpretación sencilla y se utiliza comúnmente en microbiología de los alimentos, en comparación con otras áreas de la ciencia donde los logaritmos en base e (ln) o logaritmos en base 2 (log2) son comúnmente usado. Esta conversión se puede realizar en Excel utilizando la función log10 o simplemente log, y la transformación inversa de los números de log a los números aritméticos se puede lograr usando 10^.

 

Sin embargo, esta transformación del logaritmo puede causar confusión si no se entienden sus consecuencias. Por ejemplo, es común sumar o restar números logarítmicos para calcular el efecto de aumentos o reducciones en la población microbiana, pero no debemos olvidar que hacerlo es equivalente a multiplicar o dividir los valores aritméticos originales.

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De hecho, un aumento de 1 unidad en el número de log10 es equivalente a un aumento de 10 veces en la escala aritmética, por lo que un aumento de 2 log10 cfu/g a 3 log10 cfu/g es equivalente a un aumento de 100 cfu/g a 1000 cfu/g. De forma similar, una disminución de 1 unidad en el número de log10 es equivalente a una disminución de 10 veces, o una reducción del 90%, en la escala aritmética, por ejemplo, una disminución de 3 log10 cfu/g a 2 log10 cfu/g es equivalente a una disminución de 1000 ufc/g a 100 ufc/g. Es importante destacar que este efecto es independiente de la concentración inicial.

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De particular importancia es el efecto de tal log-transformación en la distribución estadística que se utiliza para caracterizar la contaminación microbiana en el producto alimenticio, que debe tenerse en cuenta al desarrollar un Criterio Mircobiológico (MC). Las poblaciones microbiológicas en los alimentos se describen a menudo utilizando una log10-distribución normal que es una distribución sesgada derecha, que se muestra en la Figura 3a. Cuando se toma una transformación log10 de números que se ajustan a una distribución log10-normal (Figura 3a), los valores log10 toman una distribución normal (Figura 3b).

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Por consiguiente, la transformación log10 es útil para analizar datos microbiológicos, ya que puede aplicarse una gama de métodos estadísticos clásicos a los datos normalmente distribuidos, por ejemplo, intervalos de confianza, análisis de regresión, prueba t y análisis de varianza.

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Por lo tanto, los recuentos microbianos primero deben ser transformados log10 antes de calcular la media y el desvío estándar (DE) de estos recuentos transformados - de lo contrario la naturaleza sesgada derecha de la distribución "inflará" estaos dos estadísticos, lo que puede resultar en resultados incorrectos.

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Sin embargo, se debe tener cuidado cuando las estadísticas calculadas - media y DE - se transforman de nuevo a la escala aritmética y cómo se interpretan los valores correspondientes. Es tentador transformar el recuento promedio log10, a través de exponenciación directa, a la escala aritmética. Sin embargo, esto conduciría a una subestimación del número "medio" de microorganismos en el alimento y a la mala posterior interpretación del riesgo, que se basa en la media aritmética (véase la figura 3). El cálculo apropiado de la media aritmética a partir de la media de los recuentos log10 se puede realizar utilizando la hoja de cálculo complementaria.

​Un punto clave a recordar es que las concentraciones microbianas son generalmente log10 transformado para el análisis de datos o para otras conveniencias como la representación gráfica. Sin embargo, hay que tener cuidado al interpretar los números log10 transformados, incluyendo cualquier estadística y manipulación matemática de los mismos, especialmente cuando se convierte de nuevo a la escala aritmética para evaluar el riesgo.

¿Cuáles son los aspectos importantes que caracterizan la distribución estadística de los microorganismos en los alimentos?

Existen muchas distribuciones estadísticas que pueden usarse para describir y modelar la contaminación microbiana de los alimentos. La aplicabilidad de una gama de distribuciones en relación con los patrones mostrados en la Figura 2 fue discutida por Bassett et al., (2010) en relación con el modelado de sistemas de alimentos reales y este es también un área de investigación en curso (Busschaert et al., 2010 González-Barrón y Butler 2011, Jongenburger, 2012, Jongenburger et al., 2012a, 2012b).

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Sin embargo, todas estas distribuciones requieren la estimación de las siguientes características importantes (o al menos algunas de ellas):

• Prevalencia: El porcentaje de unidades de alimentos en el lote que están contaminadas. La importancia de este parámetro depende del organismo de interés, y suele usarse conjuntamente con patógenos que pueden ocurrir a concentraciones muy bajas y una prueba microbiológica basada en la ausencia / presencia. Se estima por la probabilidad de detección de la unidad analítica.

• Media / Promedio (μ): El recuento microbiano "típico" (log10) que se puede esperar a largo plazo. La media puede calcularse a partir de unidades contaminadas solamente o de todas las unidades, dependiendo de la distribución que se está modelando.

• Desviación estándar (DE): La variabilidad entre los recuentos microbianos (log10) entre muestras / unidades analíticas del mismo alimento. El DE ​​también se puede calcular a partir de unidades contaminadas solamente o de todas las unidades, dependiendo de la distribución que está siendo modelada.

• Forma: La forma de la distribución de los conteos (por ejemplo, Figura 3) influye en la distribución matemática que se puede utilizar para modelarlos. La herramienta histograma es útil para visualizar dicha forma.

A menudo no hay una respuesta simple en cuanto a qué distribución podría ser más apropiado en cualquier circunstancia particular. De hecho, la única manera de responder a esta pregunta es a través de la recolección y análisis de datos. Esto se debe a que los datos nos permiten estimar los parámetros identificados anteriormente y esto nos permite hacer suposiciones realistas al desarrollar los CM y elegir un plan de muestreo.

¿Qué pasa si no tenemos datos para determinar la distribución de microorganismos en nuestro alimento?

A veces es necesario desarrollar un plan de muestreo sin el beneficio de los datos necesarios para evaluar la aplicabilidad y validez de todos los parámetros descritos anteriormente. Mientras que la precaución debe ser aplicada en tales circunstancias, las siguientes aproximaciones pueden ayudar:

1. ¿Hay literatura para productos / producción de alimentos similares usando métodos de ensayos microbiológicos semejantes? Si es así, decidir si la media, el DE, la probabilidad de detección de la unidad analítica y las estimaciones de forma de estas fuentes podrían proporcionar un punto de partida razonable.

2. Si no existe información publicada, suponga que la distribución de los conteos microbianos entre diferentes unidades alimentarias puede describirse mediante una distribución log10-normal (ver Figura 3).

3. Si no existe información publicada, elija un valor para la variabilidad en log10 recuentos microbianos (DE) entre unidades de alimentos dentro de un lote. La experiencia y la investigación demuestran que existen valores razonables de partida para la variabilidad en los recuentos microbianos para diferentes productos alimenticios; la ICMSF proporciona alguna orientación en relación a esto. Por ejemplo, van Schothorst et al., (2009) discuten escenarios donde utilizan un DE de:

• 0,2 log10 cfu/g para alimentos bien mezclados, como líquidos;

• 0,4 log10 ufc/g en alimentos razonablemente mezclados, como la carne molida; y

• 0,8 log10 cfu/g para los alimentos menos bien mezclados. Mientras que DEs más grandes pueden ser apropiados cuando se produce aglomeración, un DE de 0,8 log10 cfu/g es generalmente un valor inicial razonable.

En consecuencia, si hay poca variabilidad en la concentración microbiana en el alimento, es decir, en procesos que están mejor controlados, entonces cualquier plan de muestreo dado será más discriminante. Es decir, la probabilidad de aceptación cae rápidamente del 100% al 0%.

 Una vez que empiece a aplicar el plan de muestreo, es importante que se capturen los datos que se generan, por ejemplo, en una hoja de cálculo o base de datos. Estos datos deben ser evaluados de forma regular para obtener mejores estimaciones de los niveles y de los patrones de contaminación en los alimentos. De esta manera, los planes de muestreo se pueden refinar con el tiempo.

 Un punto clave a recordar es que es mejor comenzar con suposiciones informadas y razonables de la probabilidad de detección, la media, el DE o la forma y afinar los supuestos iniciales una vez que se disponga de mejores datos que no hacer nada.

¿Importa la distribución estadística que usamos para describir la contaminación microbiana?

La razón por la que se usa una distribución para describir la contaminación microbiana en el lote de alimentos es que esto describe el patrón de niveles de contaminación (alto, bajo, detectado, no detectado, etc.) entre las unidades de muestra elegidas al azar (desde el mismo lote). Conocer el patrón nos permite calcular la probabilidad de que dichos lotes sean rechazados cuando se utilicen planes de muestreo.

​Por consiguiente, es importante que se utilice una distribución estadística apropiada o una combinación de distribuciones estadísticas para calcular la frecuencia con la que se puede esperar que los lotes con una concentración microbiológica particular se acepten y rechacen. Como se mencionó anteriormente, un defecto común es asumir una distribución log10-normal si no hay mejor u otra información disponible. Sin embargo, son posibles otras distribuciones y sus combinaciones y éstas influirán en la forma de la curva operativas características (OC).

​Sin embargo, los principios estadísticos no se modifican, independientemente de la distribución estadística que se utilice. En consecuencia, se ilustran estos principios aquí haciendo algunas suposiciones simplificadoras, que permiten cálculos de probabilidad fáciles usando la hoja de cálculo complementaria. Sin embargo, se pueden evaluar distintas distribuciones estadísticas utilizando herramientas más avanzadas, como las herramientas de la FAO / OMS en la Web (http://www.fstools.org/sampling) o las de la CMSF (http://www.icmsf.org/).

​​Fuente:

• Statistical aspects of microbiological criteria related to foods: a risk manager’s guide. WHO – FAO. 2016.