Actualizaciones sobre Límite de Detección (LOD) y Cuantificación (LOQ) en Análisis Químico

por Sergio Chesniuk 30 de mayo de 2025

Introducción

El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) son parámetros esenciales que indican la sensibilidad de un método analítico. En los últimos años (aprox. 2019–2024) se han producido avances significativos en su definición, cálculo y aplicación, impulsados por nuevas normativas, enfoques estadísticos modernos y mejoras instrumentales. Históricamente han existido múltiples definiciones y métodos de cálculo, generando confusión. Organismos internacionales como ISO e IUPAC han buscado armonizar criterios desde hace décadas, y más recientemente agencias regulatorias (FDA, EMA), farmacopéias y organizaciones como AOAC han actualizado guías para reflejar metodologías más uniformes y robustas. A continuación se presentan las actualizaciones normativas, los nuevos métodos estadísticos propuestos, las adaptaciones específicas en técnicas instrumentales (ICP-MS, HPLC, GC-MS, UV-Vis) y las tendencias emergentes en investigación sobre LOD/LOQ, junto con un análisis crítico en comparación con los enfoques tradicionales.

Es importante señalar que el término 'sensibilidad' en química analítica puede referirse a dos conceptos distintos. Por un lado, según algunas guías y organismos metrológicos como Eurachem e IUPAC, se define como la pendiente de la curva de calibración, indicando la magnitud del cambio en la señal de respuesta del instrumento por unidad de cambio en la concentración del analito. Por otro lado, y en el contexto más común al hablar de análisis de trazas, 'sensibilidad' describe la capacidad de un método para detectar o cuantificar cantidades muy bajas de un analito. En esta publicación, cuando utilizamos el término 'sensibilidad' en relación con LOD y LOQ, nos referimos principalmente a esta segunda acepción, es decir, a la capacidad del método para operar eficazmente a bajas concentraciones.

1. Cambios normativos recientes en definiciones y validación de LOD/LOQ

En los últimos 3–5 años se han publicado guías y normas revisadas que refinan las definiciones de LOD/LOQ y sus procedimientos de validación:

Armonización ISO–IUPAC: ISO e IUPAC han reforzado la consistencia terminológica. La serie de normas ISO 11843 sobre capacidad de detección equipara el término valor mínimo detectable con el LOD definido por IUPAC. Un informe técnico reciente (ISO/TR 11843-8:2021) vincula explícitamente los conceptos de ISO e IUPAC, reconociendo la definición de IUPAC (desde 1995) como referencia básica para el límite de detección. Esto consolida la base estadística clásica de Currie (1968/1975) –que define LOD en función de errores α y β de falso positivo/negativo– dentro de la terminología de ISO. En esencia, se reafirma el LOD como “la cantidad más baja distinguible de la ausencia del analito con un nivel razonable de certeza”.
ICH Q2(R2) (2022-2023) – Validación analítica: El Consorcio ICH revisó la guía de validación de métodos analíticos Q2(R2) (borrador Step 2 en 2022, finalizada en 2023) para sustituir a la antigua Q2(R1) de 1995. Esta revisión, adoptada por FDA, EMA y otras autoridades en 2023-2024, mantiene la definición fundamental: LOD = 3.3·σ/S y LOQ = 10·σ/S (si la respuesta es lineal). ICH Q2(R2) continúa recomendando enfoques clásicos: por ejemplo, calcular LOD/LOQ a partir de la relación señal/ruido (S/N) o la desviación estándar (σ) de la respuesta y la pendiente (S) de la curva de calibración. En métodos cromatográficos se acepta típicamente S/N ≥3:1 para LOD y ≥10:1 para LOQ. Sin embargo, la nueva guía introduce algunas novedades importantes respecto a Q2(R1): (1) Validación de límites bajos con datos experimentales, recomendando verificar el LOQ mediante estudios de exactitud y precisión en ese nivel en lugar de solo calcularlo teóricamente. De hecho, se sugiere que el LOQ se valide directamente como el nivel más bajo que cumple criterios de sesgo e imprecisión aceptables. (2) Métodos multivariados: por primera vez se abordan procedimientos para métodos multivariables (por ej. espectroscopía con muchos datos), añadiendo criterios para validación de métodos quimiométricos o basados en modelos quimiométricos. Esto llena un vacío, ya que Q2(R1) se centraba en métodos univariantes. (3) Integración con el ciclo de vida del método: la robustez y otros parámetros ahora se consideran parte del desarrollo (ver ICH Q14) más que de la validación formal. En resumen, Q2(R2) moderniza la validación: mantiene los fundamentos (incluyendo cómo definir LOD/LOQ) pero enfatiza su verificación práctica.
FDA y EMA: Estas agencias están adoptando las guías ICH revisadas. En marzo de 2024 FDA actualizó su guía de validación analítica, alineándola con ICH Q2(R2) después de décadas sin cambios. Entre los puntos destacados está la reafirmación de que LOD no es requerido en todos los casos (solo si es relevante, e.g. impurezas), mientras que LOQ sí debe establecerse para métodos cuantitativos. Además, la FDA incorpora la validación de métodos con datos multivariantes, reflejando lo indicado en ICH Q2(R2). Por su parte, EMA y otras autoridades del ICH adoptarán Q2(R2) en sus propios marcos regulatorios durante 2023–2024.
Farmacopeas (USP/Ph. Eur.) y guías ICH relacionadas: Las farmacopeas se han alineado con estas directrices. Por ejemplo, USP implementó capítulos <232>/<233> para impurezas elementales (ver más abajo) y ha publicado capítulos informativos sobre determinación de límites de detección/cuantificación en el contexto de incertidumbre (USP <1210> y <1850>, 2019–2020). Asimismo, ICH lanzó la guía M10 (2022) para validación de métodos bioanalíticos, que armoniza criterios globales. En ella se define el LLOQ (Lower LOQ) como la concentración más baja del calibrador que puede cuantificarse con exactitud y precisión aceptables (±20% de error y ≤20% CV). M10 enfatiza que en bioanálisis normalmente no se reporta LOD sino solo LOQ, dado que lo importante es el nivel cuantificable mínimo para reportar concentraciones en muestras biológicas. Esta filosofía –focalizarse en LOQ práctico más que en LOD teórico– refleja una tendencia general en áreas regulatorias.
AOAC INTERNATIONAL: En 2016 AOAC publicó guías (Appendix F: Standard Method Performance Requirements) que siguen vigentes y se han aplicado ampliamente en los últimos años. AOAC define típicamente LOQ como la media del blanco más 10 veces la desviación estándar del blanco, y LOD ~ 3 veces la desviación estándar del blanco, aunque en métodos de residuos se adoptan enfoques específicos. Por ejemplo, para métodos con un límite máximo (MRL) regulatorio dado, AOAC sugiere asegurar que LOD sea una fracción de ese MRL (20% o 40% según el nivel). Esto significa que, en análisis de alimentos o ambientales, las metodologías deben ser suficientemente sensibles para detectar el analito muy por debajo del límite legal. En general, AOAC y organismos similares insisten en validar experimentalmente estos límites (p.ej. analizando replicados de blanco fortificado a niveles cercanos al LOQ) en lugar de depender solo de cálculos teóricos.
Otras normativas y guías: La ISO/IEC 17025:2017 (acreditación de laboratorios) exige que los laboratorios estimen los LOD/LOQ cuando sean relevantes, asegurando la trazabilidad de su cálculo. En la Unión Europea, la guía SANTE/2021 para métodos de plaguicidas establece que generalmente los métodos deben alcanzar un LOQ ≤0,01 mg/kg en alimentos (el “default MRL” más bajo) a menos que el MRL regulatorio sea aún inferior. Si el MRL de una sustancia es mayor a 0,01 mg/kg, se permite que el LOQ coincida con ese valor más alto, pero nunca por encima. Esto ha impulsado mejoras en sensibilidad de métodos cromatográficos con MS para cumplir con dichos requerimientos (ver sección instrumental). En el ámbito medioambiental, la EPA actualizó en 2016 su procedimiento para el Method Detection Limit (MDL), ahora considerando tanto muestras en blanco como muestras fortificadas de bajo nivel para una estimación más robusta del LOD en agua y suelos.

En síntesis, las normativas recientes no redefinen radicalmente LOD/LOQ, pero sí refinan su estimación y uso práctico. Persiste el concepto clásico (LOD asociado a ~3σ_blanco, LOQ a ~10σ), pero con mayor énfasis en demostrar que el método puede realmente detectar o cuantificar en esos niveles con la precisión requerida. También se observa una convergencia internacional: distintas entidades (ISO, IUPAC, FDA, EMA, AOAC, ICH) convergen hacia definiciones armonizadas y requisitos similares, reduciendo discrepancias históricas. La incorporación de nuevos tipos de métodos (p.ej. modelos multivariados, métodos bioanalíticos modernos) en las guías oficiales evidencia la adaptación de los criterios de LOD/LOQ a la realidad actual de los laboratorios.

2. Nuevos métodos estadísticos para estimar LOD y LOQ

Junto a las definiciones normativas, en los últimos años han emergido métodos estadísticos y enfoques experimentales innovadores para calcular LOD/LOQ de forma más sólida:

Enfoques Bayesianos: Una de las tendencias destacadas es la aplicación de la inferencia bayesiana para la estimación de límites de detección. A diferencia del enfoque frecuentista clásico (que asume distribuciones simétricas alrededor de cero y posibilita resultados negativos en blancos), el método bayesiano permite incorporar información a priori y restricciones lógicas (p.ej. que la concentración no puede ser negativa). Esto conduce a estimaciones más realistas cuando se trabaja cerca del cero. En un estudio (Flores et al., 2018) se compararon los fundamentos estadísticos de los límites analíticos bajo enfoques frecuentista vs bayesiano, concluyendo que el tratamiento bayesiano produce resultados más coherentes físicamente en niveles muy bajos del analito. Básicamente, el enfoque bayesiano combina la evidencia experimental (datos de blancos y muestras) con distribuciones priori del analito, de modo que el cálculo del LOD/LOQ queda condicionado a que la concentración estimada sea positiva. Esto evita, por ejemplo, la paradoja de obtener concentraciones “negativas” por debajo del blanco que ocurre con métodos tradicionales. Como resultado, algunos autores proponen que, en lugar de reportar un LOD numérico poco intuitivo, se informe “el menor valor cuantificable dentro del rango de medida junto con su incertidumbre”, lo cual sería más informativo para el usuario. En general, la metodología bayesiana ofrece una forma de incluir explícitamente la probabilidad de error en la definición de detección: por ejemplo, fijando directamente una probabilidad posterior deseada de que una muestra realmente contenga analito dado el resultado observado. Si bien estas técnicas aún no están incorporadas en normas oficiales, han ganado atención en la literatura por su solidez teórica.
Métodos robustos y estimación por incertidumbre: Otro campo de desarrollo es el uso de la incertidumbre de medida como criterio para LOD/LOQ. En lugar de depender solo de σ del blanco, se evalúa la incertidumbre combinada del método en bajas concentraciones. Por ejemplo, la Royal Society of Chemistry propuso en 2008 un enfoque basado en incertidumbre para mensurandos no-negativos como alternativa al LOD convencional. Recientemente, el concepto de perfil de incertidumbre o perfil de exactitud ha madurado, especialmente en química farmacéutica: El perfil de exactitud (desarrollado por la comisión SFSTP en Europa) utiliza intervalos de tolerancia estadísticos para evaluar si el error total del método se mantiene dentro de límites aceptables en todo el rango, especialmente cerca del LOQ. En este enfoque, el LOQ se define como la concentración más baja que puede cuantificarse con un error total (sesgo + incertidumbre) menor que cierto criterio (típicamente ±20%). Así, en vez de una razón fija 10:1, el LOQ resulta del punto donde el intervalo de confianza de las mediciones deja de cumplir los límites de ±20% de error. Herramientas gráficas como el accuracy profile permiten visualizar esto. Este método, junto con perfiles de incertidumbre, aporta una visión más completa de la performance del método en la región de LOQ comparado con los enfoques tradicionales y ha sido adoptado en algunos laboratorios farmacéuticos para validar métodos de impurezas y bioanálisis. En la misma línea, se han recomendado regresiones ponderadas o no lineales para mejorar la estimación en la zona baja: por ejemplo, usar regresión ponderada 1/x o transformaciones para dar más peso a los puntos bajos puede reducir el error en el cálculo de LOD/LOQ. Estos ajustes robustos ayudan a evitar que la heterocedasticidad (mayor dispersión en alta concentración) infle artificialmente la estimación de LOD.
Cálculo a partir de la curva de calibración (Hubaux-Vos y variantes): El método clásico de Hubaux-Vos (1970) para LOD/LOQ, que calcula el punto de intersección de intervalos de confianza de la recta de calibración con el eje de concentraciones, sigue siendo referenciado en la literatura reciente como un enfoque riguroso. Este método y sus derivados (p.ej. usando la desviación estándar de los interceptos de regresión) proporcionan un LOD ligado a una probabilidad de falso positivo/negativo específica. En los últimos años han aparecido tutoriales y revisiones actualizadas explicando cómo implementar estos cálculos con software moderno. Asimismo, para calibraciones no lineales, se han desarrollado algoritmos iterativos: en lugar de una fórmula cerrada, se busca la concentración más baja que todavía produce una señal significativamente distinta del blanco según el modelo de respuesta. Por ejemplo, en inmunoensayos sigmoideos o espectros de saturación, se puede calcular el LOD resolviendo la ecuación de la curva para cuando la señal = señal_blanco + 3·SD. Aunque no hay una norma universal, en publicaciones recientes se documenta la aplicación de estos procedimientos caso por caso.
Enfoques multivariados y de reconocimiento de patrones: En métodos basados en modelos multivariados (como PLS, redes neuronales o machine learning aplicados a datos espectrales), la definición de LOD/LOQ es menos directa, ya que la respuesta no es un único número sencillo. Investigaciones recientes han propuesto definir un “LOD multivariante” basado en la incertidumbre de predicción del modelo. Por ejemplo, un estudio de 2021 sugiere obtener no un único valor sino un intervalo de LOD en modelos PLS, calculando la mínima concentración detectable con cierta probabilidad en función de las distribuciones de error del modelo. También se ha visto que modelos de aprendizaje automático pueden lograr menores LOD aparentes que calibraciones univariantes equivalentes al aprovechar patrones complejos. Sin embargo, trasladar estos LOD multivariados al lenguaje de validación tradicional es complejo. Las guías (como ICH Q2(R2)) indican que para métodos multivariados de identificación se deben aportar métricas de error del modelo, pero todavía no establecen fórmulas específicas de LOD. Este es un frente activo de investigación estadística en quimiometría.
Comparación crítica de métodos de cálculo: Dado que existen múltiples maneras de calcular LOD/LOQ, algunos trabajos recientes han comparado cuantitativamente sus resultados. Por ejemplo, Ershadi y Shayanfar (2018) recalcularon LOD y LOQ de métodos espectroscópicos por diversas técnicas (ecuación 3σ, 3.3σ, S/N, regresión, etc.) y los compararon con el LLOQ regulatorio de FDA, encontrando diferencias sustanciales según el criterio usado. Estas disparidades pueden ser de varios órdenes de magnitud en algunos casos, lo cual es alarmante al evaluar la sensibilidad. Los autores subrayan que esta variabilidad debe tenerse en cuenta al reportar LOD/LOQ, y recomiendan especificar el método de cálculo utilizado. En general, hay un consenso emergente en la literatura de que LOD y LOQ no son números absolutos del método, sino estimaciones dependientes del criterio estadístico elegido y de los supuestos de distribución. Por ello, se promueve mayor transparencia (declarar cómo se obtuvo) y en lo posible validar experimentalmente que esos niveles realmente funcionan en la práctica analítica.

En resumen, las nuevas propuestas estadístico-experimentales buscan hacer más robusta y útil la estimación de LOD/LOQ. Ya sea incorporando conocimiento previo (Bayes), considerando la incertidumbre total, aplicando métodos robustos o adaptando el cálculo a nuevos tipos de datos, la meta es la misma: superar las limitaciones del mero enfoque clásico 3σ y garantizar que el “límite” declarado tenga significado real en términos de probabilidad de detección o cuantificación fiable. Aunque los enfoques tradicionales siguen siendo los más usados (por su sencillez y aceptación normativa), en la práctica avanzada de metrología química se observa esta diversificación metodológica para caracterizar mejor la sensibilidad de los métodos.

3. Aplicaciones y adaptaciones en técnicas instrumentales específicas

La expresión concreta de LOD y LOQ puede variar según la técnica analítica, ya que cada instrumento tiene fuentes de ruido y características diferentes. En los últimos años, se han implementado adaptaciones para estimar y mejorar LOD/LOQ en varias técnicas clave:

3.1 ICP-MS y técnicas de espectrometría atómica

La Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS) es reconocida por sus ultra-bajos límites de detección para elementos (traza a nivel de ng/L o inferiores). Los avances instrumentales recientes (ICP-MS de triple cuádruplo, células de colisión/reacción, mejor control de interferencias) han empujado los LOD aún más abajo. Por ejemplo, se reportó la determinación de ^226Ra en orina mediante ICP-MS/MS con un LOD de apenas 0,007 pg/mL (7×10^-15 g/mL), una sensibilidad extraordinaria impensable décadas atrás. Este tipo de mejoras ha sido crucial para aplicaciones emergentes como la identificación de nanopartículas inorgánicas o radionúclidos en matrices biológicas.

En cuanto a normativas, la introducción de los lineamientos de impurezas elementales (ICH Q3D para fármacos y capítulos <232>/<233> USP) hacia 2018 ha impuesto requisitos estrictos: se exige que el LOQ para metales tóxicos sea ≤30% de la dosis permitida (PDE) de cada elemento. En la práctica, esto equivale a niveles de partes por billón (ppb) o menos para muchos elementos, lo que obliga al uso de ICP-MS en la mayoría de los casos. De hecho, el “umbral de control” típico del 30% de la PDE en ICH Q3D conlleva límites en el orden de pocos ppm o menos en el producto, y solo técnicas como ICP-MS pueden lograr semejantes LOD/LOQ de forma confiable. Por ejemplo, para plomo en un fármaco oral con PDE de 5 µg/día, el LOQ requerido sería ~1.5 µg/día repartido en la cantidad diaria de dosis (lo que puede traducir a <0,1 ppm en el producto final), algo alcanzable con ICP-MS pero difícil con ICP-OES.

En ICP-OES (espectrometría de emisión óptica), los límites de detección son típicamente uno o dos órdenes de magnitud más altos que ICP-MS. Sin embargo, la tecnología reciente (mejores detectores CCD, nebulizadores más eficientes) también ha mejorado los LOD de ICP-OES, haciéndola viable en algunos casos donde antes solo ICP-MS podía usarse. Aun así, para trazas ultra bajas, ICP-MS sigue siendo la elección: la literatura destaca que la detección de la mayoría de elementos es del orden de sub-ppt con ICP-MS (10^-12 g/mL o incluso 10^-15 g/mL para ciertos isotopos). Un desafío en estas técnicas es que muchas veces el ruido no es electrónico sino de fondo químico o contaminación. Por ello, una tendencia práctica importante es mejorar las prácticas de blanco y control de contaminación (laboratorios de ultratraza): emplear salas limpias, reactivos ultrapuros y recipientes descontaminados es clave para aprovechar el potencial instrumental y que el LOD real esté limitado por el instrumento y no por el ruido del blanco. En publicaciones recientes se enfatiza que la eliminación de contaminantes es crítica para lograr el LOD más bajo en ICP-MS.

En cuanto al cálculo de LOD/LOQ en espectrometría atómica, se suele emplear el criterio 3σ/10σ a partir de mediciones repetidas de blancos o de señales de fondo en matrices libres de analito. Algunas guías (EPA, ISO) definen el “instrument detection limit” (IDL) como 3σ del blanco instrumental (ej. solución de diluyente), y el “method detection limit” (MDL) como un LOD verificado mediante análisis de múltiples muestras reales de matriz fortificadas a bajo nivel. Esta distinción ha cobrado relevancia: por ejemplo, un ICP-MS puede tener un IDL de 0,1 ng/L para Cd en agua ultrapura, pero el MDL en agua natural (con matriz compleja) quizás sea 0,5 ng/L debido a ruido de matriz. Los laboratorios modernos suelen reportar el LOD/LOQ logrado para cada matriz de ensayo, alineándose con la visión metrológica de que el límite de detección no es solo propiedad del instrumento, sino del método completo aplicado a la muestra.

3.2 Cromatografía Líquida (HPLC y UPLC)

En cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), los LOD/LOQ dependen en gran medida del detector acoplado. Tradicionalmente, con detectores UV-Vis o índice de refracción, las sensibilidades eran limitadas (LOD en el rango de 10^−6 a 10^−7 M para compuestos típicos, i.e. microgramos/mL). No obstante, los avances en UHPLC (ultra high-performance LC) han reducido la dispersión de picos, aumentando la relación señal/ruido. Combinado con detectores más sensibles, esto ha llevado a mejoras modestas en LOD para detección UV. Además, la derivatización química sigue empleándose para mejorar la detección de analitos poco cromóforos: por ejemplo, convertir un pesticida en un derivado fuorescente post-columna puede disminuir el LOD varias veces.

El cambio más revolucionario ha sido la incorporación masiva de detectores de espectrometría de masas acoplados (LC–MS). En los últimos 5 años, prácticamente todos los laboratorios de residuales y farmacéuticos han migrado a HPLC-MS/MS (tándem MS) para analitos traza, debido a su enorme ganancia en sensibilidad y selectividad. Un espectrómetro de masas triple cuadrupolo puede lograr LOD de picogramos absolutOS, superando por órdenes de magnitud al UV. Por ejemplo, en análisis de micotoxinas o contaminantes orgánicos, métodos LC–MS/MS lograron rutinariamente LOQs de 0,01 mg/kg (10 ppb) o inferiores en alimentos, cumpliendo con la exigencia general de la UE de LOQ ≤0,01 mg/kg para residuos de pesticidas. De hecho, la normativa europea establece 0,01 mg/kg como “default LOQ” y los métodos actuales (usando MS/MS) normalmente alcanzan entre 0,001 y 0,005 mg/kg, proporcionando un margen de seguridad. Esto representa un avance notable respecto a técnicas anteriores (por ejemplo, hace 15 años con HPLC-UV costaba llegar a 0,05–0,1 mg/kg).

Una adaptación metodológica importante en HPLC es el uso de calibraciones con ponderación para obtener mejores estimaciones en el extremo bajo: es común validar el LOQ con calibraciones ponderadas 1/x o 1/x², de modo que el ajuste se centre en los niveles bajos. Así se minimiza el error relativo en esas concentraciones, asegurando que el LOQ estimado cumpla los criterios de exactitud. Las guías modernas (ej. SANTE/2021 para pesticidas) requieren demostrar linealidad y precisión en el punto LOQ con al menos 5 repeticiones y recuperación 70–120%.

En cuanto a cómo se calcula y valida LOD/LOQ en HPLC: para detectores cromatográficos con ruido de base (UV, fluorescencia), el enfoque S/N directo es muy usado. Software de cromatografía suele calcular automáticamente S/N en el pico más pequeño detectable. Las guías (USP, ICH) recomiendan S/N≥3 para LOD y ≥10 para LOQ. No obstante, se aconseja también verificar con muestras reales diluidas: por ejemplo, preparar una solución ~LOQ teórica y analizarla varias veces para comprobar desviación estándar y sesgo. En HPLC-MS, a veces el concepto de S/N se sustituye por el de conteo mínimo de iones o por criterio estadístico de la calibración: se considera LOD la concentración cuyo pico produce por lo menos X cuentas (ej. >100 conteos) y cumple con la identificación correcta de masas de fragmento, etc. El LOQ se suele definir como el nivel más bajo de la curva de calibración que se cuantifica con precisión aceptable (similar al LLOQ en bioanálisis). Esto refleja que en MS el ruido puede ser cero count, por lo que el límite está más determinado por la mínima señal distinguible del cero y por la reproducibilidad de esa señal.

En tendencias instrumentales, otro punto es la combinación de HPLC con detectores de arreglo de diodos (DAD) y mejor procesamiento digital de señales, que ha permitido resucitar la detección UV-Vis hasta cierto punto. Técnicas de filtrado de ruido, corrección de fondo móvil e incluso algoritmos de deconvolución de picos ocultos en el ruido (utilizando que los espectros UV tienen formas conocidas) se han explorado en literatura reciente para extender un poco más la sensibilidad de HPLC-DAD. Aunque no sustituyen al MS, estas mejoras pueden ser útiles cuando MS no está disponible o para reducir falsos positivos en matrices complejas.

3.3 Cromatografía de Gases acoplada a MS (GC-MS)

La cromatografía de gases con espectrometría de masas es otra técnica fundamental en la cual los LOD/LOQ han mejorado drásticamente con la evolución tecnológica. Los avances en GC-MS/MS (tándem) durante los últimos 5 años permiten detectar compuestos termoestables en niveles ultratraza a pesar de matrices complicadas. Por ejemplo, en control de contaminantes orgánicos volátiles y semivolátiles, hoy se logran LOQs de 0,01 mg/kg o inferiores rutinariamente para pesticidas, bifenilos policlorados, dioxinas, etc., gracias a la alta selectividad de la MS/MS que elimina el ruido de fondo químico. Una referencia europea señala que métodos de GC-MS/MS pueden monitorear residuos de ciertos fungicidas a LOQ 0,01 mg/kg sin problema.

Respecto a las estrategias de cálculo, en GC-MS se suelen distinguir: (a) LOD/LOQ instrumentales (inyectando estándares en solvente) y (b) LOD/LOQ de método (analizando muestra real procesada). Los laboratorios suelen reportar lo segundo. El LOD instrumental muchas veces es bajísimo (p.ej. un GC-MS de alta resolución puede detectar femtogramas en el espectrómetro), pero el LOD de método quizás esté limitado por la eficiencia de extracción o limpieza de la muestra. En consecuencia, los protocolos de validación (p.ej. SANTE/2021 para pesticidas) exigen demostrar que el método completo puede recuperar el analito en el nivel LOQ con la precisión adecuada.

Mejoras instrumentales recientes en GC-MS que impactan la sensibilidad incluyen: fuentes de ionización optimizadas (por ejemplo, EI de energía variable para maximizar señal del analito sobre interferentes), sistemas de inyección enriquecedora (P&T, SPME mejoradas, inyección en frío de grandes volúmenes) que introducen más analito sin sobrecargar el cromatógrafo, y detectores de masas más sensibles (triples cuadrupolos con mejores multipliers, o Orbitraps/TOF de alta resolución con menor ruido electrónico). Asimismo, la capacidad de hacer monitorización de iones seleccionados (SIM) o transiciones específicas (MRM) focaliza la detección, reduciendo drásticamente el ruido y mejorando la relación S/N en órdenes de magnitud respecto a un escaneo completo.

Un ejemplo concreto: en control ambiental de aguas, los métodos EPA recientes para plaguicidas por GC-MS/MS alcanzan LOD en el orden de ng/L, algo posible gracias a seleccionar las transiciones iónicas más sensibles y eliminar casi por completo señales de fondo. Esto ilustra cómo la definición práctica de LOD en GC-MS muchas veces se traduce a “la menor concentración que produce un pico con ratio señal/ruido ≥3 en el cromatograma de iones específicos y cuya identidad puede confirmarse por los fragmentos característicos”.

Cabe mencionar también el emergente uso de GC acoplado a detectores especializados (no MS) para ciertas tareas: por ejemplo, detectores de captura de electrones (ECD) o fotométricos de llama (FPD) que en algunos casos pueden ser más sensibles que MS para compuestos particulares (p.ej. ECD para pesticidas clorados). En estos detectores, el ruido de base y la definición del LOD siguen la lógica clásica (p. ej. LOD = 3σ del ruido base en el cromatograma). Los fabricantes han mejorado la electrónica y la gestión de gases para reducir ruido en tales detectores, logrando LOD un poco mejores. No obstante, la tendencia general es que GC-MS/MS ha reemplazado a la mayoría de detectores convencionales cuando se busca la máxima sensibilidad y selectividad, facilitando también la confirmación de identidad en el LOD (reduciendo riesgos de falsos positivos).

3.4 Espectrofotometría UV-Visible

La espectrofotometría UV-Vis es una técnica madura cuyos límites de detección no han cambiado radicalmente, pero aún así ha visto algunas innovaciones. El LOD típico en UV-Vis está limitado por el ruido electrónico y de fuente de luz, así como por la linealidad en absorbancias muy bajas. En práctica, detectar absorbancias menores ~0,001 absorbancias es difícil en muchos equipos, lo que fija un LOD práctico de ~1×10^-6 – 1×10^-7 M para compuestos con coeficientes de absorción moderados.

Recientes mejoras incluyen el uso de celdas de trayectoria larga o celdas acopladas a cavidades reflectivas (técnicas de cavity-enhanced absorption), con las cuales se extiende la longitud efectiva y se pueden detectar absorciones muy débiles – estas metodologías han logrado bajar LOD en análisis de gases (ej. detección de NO2 atmosférico a partes por trillón). Sin embargo, en el laboratorio químico rutinario, la UV-Vis convencional sigue teniendo limitaciones de sensibilidad. Se han adoptado algunos trucos: la corrección de línea base con referencias de matriz (doble haz con celda de referencia conteniendo matriz en blanco) ayuda a restar el fondo y reducir ruido de fondo. También se han aplicado algoritmos de suavizado y promediado de señales para mejorar S/N, aprovechando que las señales UV-Vis son continuas en el tiempo.

En cuanto a LOD/LOQ, para UV-Vis la definición clásica (mínima concentración distinguible del blanco con cierta confianza) se calcula midiendo absorción de varias réplicas de blanco. Por ejemplo, en farmacopéa se suele decir: LOD = 3·SD_blanco, LOQ = 10·SD_blanco en términos de absorbancia, luego convertido a concentración mediante la pendiente (Ley de Beer). Esto supone un régimen lineal; si la respuesta se desvía de la linealidad a muy baja concentración, se recomienda hacer la calibración cerca del LOD mismo.

Una adaptación interesante ha sido la aplicación de métodos quimiométricos a espectros UV-Vis complejos (como espectros de mezclas): usando resoluciones multivariadas (e.g. algoritmos de deconvolución) se puede detectar la presencia de un analito aún si su banda está solapada con otras, mejorando un tipo de “LOD de identificación”. Pero en general, si se trata de un solo analito con una banda aislada, el límite está dado por la relación señal/ruido instrumental.

No debemos olvidar que para superar los LOD limitados de UV-Vis a menudo se recurre a cambiar de técnica: por ejemplo, para una sustancia poco absorbente a la cual necesitamos detectar a niveles de nanogramos, lo usual es derivatizar a un compuesto altamente fluorescente y usar fluorimetría (mucho más sensible), o directamente emplear LC-MS. Por ello, en los últimos años la UV-Vis se reserva para análisis donde el analito está en concentración relativamente alta (por encima de su LOQ que suele ser en el orden de 0,1–1 µg/mL para colorantes comunes), o para estudios cinéticos donde la sensibilidad es suficiente. La investigación actual en esta técnica se enfoca más en portabilidad y miniaturización (espectrofotómetros compactos, sensores LED) que en extender el LOD, ya que para ultratrazas se prefiere otras técnicas.

En conclusión, cada técnica instrumental tiene consideraciones particulares para LOD/LOQ: en ICP-MS y GC-MS el desafío es evitar falsas señales de fondo (contaminación o interferencias) dado que la sensibilidad intrínseca es altísima; en HPLC-MS se trata de asegurar que el sistema completo (muestra + instrumentación) sostenga esa sensibilidad teórica; y en UV-Vis se trabaja cerca de límites físicos de detección óptica, por lo que las mejoras son modestas. Las adaptaciones implementadas en años recientes –desde triple cuadrupolos en ICP/GC-MS hasta algoritmos de procesado en UV– han empujado los límites un poco más lejos, permitiendo cumplir con regulaciones más estrictas y descubrir analitos a niveles antes inalcanzables.

4. Tendencias emergentes y líneas de investigación actuales en LOD/LOQ

Además de los aspectos ya discutidos, existen líneas de investigación activas y tendencias que perfilan cómo se manejarán los LOD/LOQ en el futuro próximo dentro de la química analítica y la metrología química:

Integración con la evaluación de la incertidumbre: Cada vez más se reconoce que el LOD/LOQ debe interpretarse junto con la incertidumbre de medición. Hay un movimiento para complementar la simple cifra de LOD con información de confianza. Por ejemplo, algunos proponen reportar “LOD = X (con Y% probabilidad de detección)” en vez de un valor absoluto, explicitando las tasas de falso positivo/falso negativo asociadas. Los metrólogos químicos enfatizan la necesidad de especificar el riesgo α (false positive) que se asume en el LOD y el riesgo β (false negative) en el LOQ. Trabajos recientes recalcan que sin esa información, comparar LOD de distintos métodos puede ser equívoco, ya que uno podría basarse en 1% de α y otro en 5%. VIM (Vocabulario Internacional de Metrología) en su próxima revisión podría incluir definiciones más claras en este sentido, armonizando terminología de “nivel crítico” (decision threshold) y “capacidad de detección” con el lenguaje estadístico.
Enfoque de límites “prácticos” vs teóricos: Como ya se mencionó, en aplicaciones reguladas se tiende a dar más importancia al LOQ práctico validado que al LOD calculado teórico. La investigación metodológica actual refuerza esto – por ejemplo, estudios en analytical quality by design sugieren diseñar métodos enfocándose desde el inicio en lograr el LOQ deseado (es decir, asegurar cierta precisión a esa concentración), en lugar de maximizar solamente la razón señal/ruido. Esto se alinea con la recomendación de Flores et al. (2018) de reportar el mínimo nivel cuantificable con su incertidumbre, en vez de confiar en un LOD abstracto. En consecuencia, es esperable que cada vez más publicaciones y laboratorios hagan énfasis en la capacidad de cuantificación mínima y en la validación de dicha capacidad (por ejemplo, incluyendo puntos de control de calidad en el LOQ durante rutinas analíticas).
Nuevos escenarios analíticos y definición de LOD/LOQ: Surgen campos donde la noción de detección se vuelve distinta. Por ejemplo, en biosensores y métodos basados en biología molecular (PCR digital, secuenciación) se habla de “limit of blank, limit of detection, limit of quantification” en términos de probabilidad de detección de eventos discretos (moléculas, células). La guía CLSI EP17-A2 (clínica, 2012) y sucesores introdujeron formalmente el Límite del Blanco (LoB) como separado del LOD: LoB es el mayor resultado esperado de un blanco (p.ej. percentil 95% de blancos), y LOD = LoB + c·σ (donde c se elige según prob. β deseada, típicamente 1.645σ adicional para β=5%). Estas ideas han permeado al análisis químico general: en métodos muy sensibles se recomienda determinar LoB experimentalmente para evitar subestimar LOD. Por ejemplo, en espectrometría de masas de alta resolución es común medir varias muestras blanco y usar la distribución de señales de fondo para establecer LoB. La distinción LoB vs LOD se convierte en importante cuando el blanco no es cero (matrices complejas donde siempre hay un ruido basal o “background”). La investigación actual sigue afinando estos conceptos para distintos tipos de métodos (p.ej., ¿cómo definir LoB en un ensayo cualitativo con resultado binario? Hay propuestas usando modelos bayesianos de tasa de falsos positivos, etc.).
LOD/LOQ en métodos cualitativos y no convencionales: La química analítica se expande a técnicas como sensores electroquímicos, dispositivos portátiles, análisis por imágenes, etc., donde la sensibilidad puede expresarse de maneras distintas. Se habla de limit of decision en ensayos cualitativos inmunológicos (con lectura tipo sí/no). Un ejemplo: kits rápidos pueden tener un LOD visual (“limit of detection by eye”) distinto al LOD instrumental si se lee con un espectrómetro. La tendencia es desarrollar métricas análogas a LOD/LOQ para estos casos – por ejemplo, concentración de corte (cut-off) en tiras reactivas, definida estadísticamente similar a un LOD. Una publicación reciente clasifica los límites en análisis cualitativo en análogos a LOD y LOQ adaptados a pruebas binarias. Esto abre un campo de investigación interesante para traducir los principios de Currie a pruebas rápidas y sensores.
Automatización y software para LOD/LOQ: Con el auge de la automatización en laboratorios, también la determinación de LOD/LOQ se está estandarizando mediante software. Hay paquetes en R, Python y herramientas comerciales que incorporan varias opciones (por ej., cálculo por regresión lineal vs por blanks vs por S/N) y permiten al analista explorar cuál se ajusta mejor a sus datos. La investigación en metrología apoya la creación de tales herramientas para minimizar errores de cálculo y para aplicar métodos más sofisticados (ej. bootstrapping o Monte Carlo para estimar la distribución del LOD). En los últimos años han aparecido tutoriales enfocados en guiar al analista en este proceso computacional, indicando que la comunidad busca difundir buenas prácticas en la estimación de estos parámetros.
Continua controversia académica: Pese a avances, el tema de LOD/LOQ sigue generando debate científico. Algunas voces critican que son “parámetros poco fiables” porque dependen de supuestos simplificados. Otros defienden su utilidad práctica argumentando que, bien definidos, sí proveen información valiosa de sensibilidad. Las tendencias señalan a un posible consenso futuro donde LOD/LOQ se enmarquen dentro de un contexto más amplio de desempeño del método (por ejemplo, integrados en los métodos de performance junto a linealidad, exactitud, etc., en lugar de tratarlos aisladamente). Eurachem y otras organizaciones educativas han publicado guías aclaratorias enfatizando qué no es el LOD (por ejemplo, no es absoluto del instrumento sino relativo al ruido, no es inmutable – debe re-evaluarse si cambia el método, etc.). Esta labor pedagógica continúa, indicando que, aunque conceptualmente el LOD existe hace décadas, todavía se están corrigiendo malas interpretaciones en la comunidad analítica.
Metodologías emergentes para mejorar la sensibilidad: Por último, vale mencionar que una línea transversal de investigación es desarrollar nuevas técnicas analíticas con LOD intrínsecamente más bajos. Ejemplos recientes incluyen la espectrometría de masas de ionización por ambient (que evita pérdidas de muestra), nanomateriales en sensores (que amplifican señales electroquímicas o ópticas) y combinaciones híbridas (ej. acoplar microextracción + detección instrumental). Cada vez que surge una técnica que mejora la sensibilidad, se reabren las discusiones de cómo definir su LOD. Por ejemplo, la detección de una sola molécula (p.ej. en microscopía de fluorescencia de molécula única) implicaría LOD ~ 1 molécula; pero en realidad en ese régimen el concepto estadístico de LOD se reemplantea en términos de probabilidad de detectar al menos una molécula presente. Estos desarrollos obligan a la metrología a evolucionar sus definiciones para que sigan siendo relevantes. La química analítica se está moviendo hacia escenarios de detección cada vez más próximos al conteo discreto de eventos (fotones, iones, moléculas), donde el ruido de fondo puede ser prácticamente nulo. En tal caso, el límite de detección pasa a depender de la confianza con que podemos afirmar que una cuenta observada no proviene de ruido aleatorio. Las herramientas bayesianas y de teoría de detección (ROC curves, etc.) que se están explorando serán la base para esas futuras definiciones.

Conclusiones

En el periodo reciente, el ámbito de LOD y LOQ en laboratorios analíticos ha visto refinamientos más que revoluciones. Las entidades normativas han actualizado guías para clarificar definiciones y requerir comprobaciones experimentales, reduciendo la ambigüedad que históricamente rodeaba a estos parámetros. Los métodos estadísticos modernos –desde enfoques bayesianos hasta perfiles de exactitud– ofrecen maneras de estimar y expresar LOD/LOQ con mayor significado práctico y control de riesgos de error, aunque coexisten con los enfoques tradicionales aceptados (3σ/10σ, S/N) que aún son predominantes por su simplicidad. Las técnicas instrumentales han logrado llevar los límites de detección a niveles insospechados: apoyadas por la espectrometría de masas y mejoras en instrumental, hoy detectamos cantidades de analito ínfimas, planteando a su vez nuevos retos para definir qué tan confiable es esa detección.

Las tendencias indican una convergencia entre la teoría metrológica y la práctica analítica: se valora más el LOQ validado con criterios de exactitud que el LOD teórico; se busca comunicar la sensibilidad junto con la incertidumbre y los riesgos de falso resultado; y se tiende a armonizar la terminología a nivel internacional. En comparación con los enfoques tradicionales, estos avances proporcionan mayor confianza y comprensión sobre lo que realmente significa “poder detectar o cuantificar” un analito a cierto nivel. Donde antes un LOD podía ser visto casi como un número mágico inherente al equipo, ahora se comprende como un parámetro estadístico que depende de cómo medimos, cómo procesamos los datos y qué nivel de certeza requerimos.

En conclusión, los últimos años han consolidado un panorama más robusto para LOD/LOQ: por un lado, límites más bajos gracias a tecnología y mejor control del ruido; por otro, definiciones más sólidas y alineadas gracias a la labor de organismos internacionales. Si bien persisten desafíos (especialmente en educar su correcto uso y en extender los conceptos a nuevas modalidades de análisis), la química analítica avanza hacia un futuro donde la sensibilidad se reporta de forma más transparente, comparable y científicamente fundamentada que nunca antes.

Referencias:

ICH Q2(R2) Guideline on Validation of Analytical Procedures (2022). Definiciones de LOD/LOQ basadas en S/N y en σ de la respuesta.
Flores, L. et al. El dilema del límite de detección en niveles cercanos a cero (2018). Comparación de enfoques frecuentista vs bayesiano y recomendación de reportar el valor cuantificable mínimo con incertidumbre.
ISO/TR 11843-8:2021. Capability of detection – Part 8. Harmonización de la terminología ISO–IUPAC y definición del límite de detección conforme IUPAC (xD).
AOAC Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements (2016). Criterios: LOQ ≈ media_blanco + 10·σ, LOD como fracción del límite regulatorio (ej. 0,2× o 0,4× MRL).
Ershadi, S. & Shayanfar, A. Are LOD and LOQ Reliable Parameters for Sensitivity Evaluation...? J. AOAC Int. 101(4), 2018. Demostración de disparidad en LOD/LOQ según método de cálculo.
European Pharm. Review (Wright, 2019). Elemental Impurities Update – ICH Q3D. Explica umbral de control 30% PDE en impurezas elementales y necesidad de ICP-MS.
Xiao et al. (2020). Determination of 226Ra in Urine using ICP-MS/MS. Ejemplo de LOD ultrabajo 0,007 pg/mL con ICP-MS de triple cuadrupolo.
SANTE/12830/2020 (EU DG SANTE). Guidance Document on Pesticide Analytical Methods. Requisito general: LOQ ≤0,01 mg/kg en métodos de residuos.
Anal. Chim. Acta (2022) – Chiappini et al. Tutorial LOD/LOQ en calibración univariante. Revisión de métodos de cálculo y uso de perfiles de exactitud/incertidumbre.
Chromatography Online – Boqué & Vander Heyden (2009). The Limit of Detection. Discusión de la controversia histórica y esfuerzos de unificación ISO/IUPAC.